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分光光度计应用常识

时间 : 2021-10-22 14:07:57 阅读 : 32

分光光度计已成为现代分子有机实验室常规仪器。常用用于定量核酸、蛋白质和细菌生长浓度。分光光度计的简单原理 分光光度计使用能够产生多种波长的光源,并通过一系列分光装置来产生具有特定波长的光源。光源通过被测样品后,部分光源被吸收,并计算样品的光吸收值,从而将光吸收值转化为样品的浓度。样品的吸光度与样品的浓度成正比。 核酸的定量 核酸的定量是分光光度计高频z大值的函数。寡核苷酸、单链和双链脱氧核糖核酸以及可定量溶解在缓冲溶液中的核糖核酸。核酸的zui高吸收峰的吸收波长为260纳米。每种核酸的分子组成不同,因此其转化系数也不同。为了量化不同类型的核酸,应事先选择相应的系数。例如,10d的吸光度分别相当于50微克/毫升dsDNA、37微克/毫升ssDNA、40微克/毫升核糖核酸和30微克/毫升寡核苷酸。通过上述系数转换测试后的吸光度值,以获得相应的样品浓度。测试前,选择正确的程序,输入储备溶液和稀释剂的体积,然后测试空白溶液和样品溶液。然而,实验并不是一帆风顺的。不稳定的读数可能会让醉头疼。仪器的灵敏度越高,吸光度漂移越大。 事实上,分光光度计的设计原理和工作原理允许吸光度值在一定范围内变化,即仪器具有一定的准确度和程度。例如,e1pp恩多夫生物光度计的准确度≤1.0%(1A)。这种测试的结果在平均值的大约1.0%之间变化是正常的。此外,核酸本身的物理化学性质、溶解核酸的缓冲溶液的酸碱度、离子浓度等。还应考虑:过高的离子浓度会导致测试期间读数漂移。因此,推荐使用具有一定酸碱度和低离子浓度的缓冲溶液,如TE,以大大稳定读数。样品的稀释浓度也是一个不可忽视的因素:因为样品中不可避免地存在一些微粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在会干扰测试结果。为了使zui大大减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸的吸光度值至少大于0.1A,并且吸光度值zui优选为0.1-1。在此范围内,粒子的干扰相对较小,结果稳定。这意味着样品的浓度不能过低或过高(超出光度计的测试范围)。后醉是经营因素。如果混合足够,则光吸收值太低,甚至为负值。混合液中不存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移严重;必须使用同一试管来测试空白溶液和样品,否则浓度差太大;转换系数与样品浓度单位相同。不能使用窗户磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色皿和其他操作项目所需的z小体积。除了核酸浓度之外,分光光度计同时显示了几个非常重要的指示样品纯度的比率,例如A260/A280比率,其用于评估样品的纯度,因为蛋白质的吸收峰是280纳米。纯样品的比例大于1.8(脱氧核糖核酸)或2.0(核糖核酸)。如果该比率低于1.8或2.0,则表明存在蛋白质或酚类物质。A230表示样品中有一些污染物,如碳水化合物、多肽、苯酚等。更纯的核酸A260/A230的比率大于2.0。A320检测溶液的浊度和其他干扰因素。纯样品,A320一般为0。 蛋白质的直接定量(紫外法) 该方法直接在280纳米波长下检测蛋白质。如果选择沃伯格公式(Warburg formula),光度计可以直接显示样品的浓度,或者选择相应的转换方法将吸光度值转换成样品的浓度。蛋白质测定的加工非常简单。 先测试空白溶液, 蛋白质通常是各种蛋白质的化合物。比色法测定基于蛋白质成分:氨基酸(如酪氨酸和丝氨酸)与其他发色基团或染料反应生成有色物质。有色物质的浓度与蛋白质与之反应的氨基酸数量直接相关,因此反映了蛋白质的浓度。比色法通常包括BCA法、布拉德福德法、劳里法和其他方法。 Lowry方法:基于zui的早期缩二脲反应并加以改进。蛋白质与Cu2反应生成蓝色反应物。然而,与缩二脲相比,洛瑞法更灵敏。缺点是需要依次加入几个不同的反应试剂。这种反应需要很长时间。易受非蛋白质物质影响;含有乙二胺四乙酸、Triton x-100、硫酸铵和其他物质的蛋白质不适合这种方法。 BCA(双苏氨酸测定)方法:这是一种相对较新且更灵敏的蛋白质检测方法。蛋白质分析在碱性溶液中与Cu2反应生成铜,铜与BCA形成螯合物,形成吸收峰在562纳米波长的紫色化合物。该化合物与蛋白质浓度之间的线性关系非常强,反应后形成的化合物非常稳定。与Lowry方法相比,该方法操作简单,灵敏度高。然而,与Lowry方法相似,它容易受到蛋白质和洗涤剂的干扰。 布拉德福德法(Bradford method):该方法的原理是蛋白质和考马斯亮蓝结合反应,产生595nm的有色化合物吸收峰。其嘴的特点是灵敏度高,是劳瑞和BCA的两倍。操作更简单、更快。只需要一个反应试剂;化合物可以稳定1小时以促进结果。而且还受到BCA劳里的一系列干扰

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